2. 陕西延长石油(集团)有限责任公司研究院, 陕西 西安 710061;
3. 西安工程大学 城市规划与工程学院, 陕西 西安 710600
载体在药物释放过程中具有重要作用。药物输送受人体不同组织器官的pH、温度、离子强度等微环境的影响较大[1]，将药物包覆在特定功能载体后再释放，有助于控制药物的释放速度、调节药物在体内的分布以及实现靶向定位给药等，减少输送过程中由于提前或滞后释放对药物疗效的影响。肠道疾病是影响人体健康的因素之一。治疗药物需经过口腔、食道、胃等多个不同的组织器官，才能到达肠道疾病部位，由于部分吸收导致血药浓度降低，影响治疗效果。通过载体包覆药物有助于维持较高的血药浓度，然而人体肠道微环境呈弱碱性，肠液中含有大量离子[2-3]，在肠道微环境下进行可控释放，pH、盐双敏性功能载体的选择是关键。
刺激响应性凝胶是一类受到pH、光、温度、盐等外界环境刺激后发生溶胀-收缩转变的智能材料[4-5]，可以作为控释药物载体。其中，pH/盐敏感性凝胶能依据体内各个器官环境存在酸碱性、离子强度的差异，使药物在特定时间和部位进行释放，从而实现靶向定位精准给药[6-7]，但对制备可控性、生物相容性、刺激响应敏感度等有较高要求。课题组前期研究发现烷基咪唑类聚离子液体凝胶载体PCnvimBr(n=2, 4, 6)，具有pH/盐双敏感性，在pH=7.4弱碱性和一定盐浓度的条件下释放药物具有一定选择性，对肠道抗菌类药物在肠道环境中释放药物具有应用价值。但是存在控释速率、药物累积释放量相对较低等问题[8]。与其他功能基团相比，分子结构中引入醚基有助于增强刺激响应性，影响凝胶与药物分子间的相互作用及药物选择性迁移[9-11]，同时，还可以提高生物降解能力并降低毒性[12]，在作为药物载体方面具有潜力。
鉴于以上分析，本文在咪唑阳离子中引入醚基功能基团，通过乙烯基咪唑类离子液体型单体的自聚反应，设计合成pH/盐双敏性的聚醚基咪唑类离子液体凝胶P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)，探讨离子液体型单体的侧链微增长对凝胶溶胀性能、生物相容性、pH和盐刺激响应等行为的影响，在此基础上，研究pH/盐双敏性P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶对肠道抗菌类中西药物的控释行为及释药机制。
1 实验材料与方法 1.1 实验材料与仪器N-乙烯基咪唑：98%，阿拉丁生化科技股份有限公司；2-氯乙基甲基醚：98%，阿拉丁生化科技股份有限公司；2-氯乙基乙醚：> 98.0%，阿拉丁生化科技股份有限公司；2-氯乙基丙醚：> 97.0%，阿拉丁生化科技股份有限公司；偶氮二异丁腈(AIBN)：97%，阿拉丁生化科技股份有限公司；N, N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)：CP，阿拉丁生化科技股份有限公司；环丙沙星(CIP)：> 98.0%，阿拉丁生化科技股份有限公司；黄连素(Ber)：98.0%，阿拉丁生化科技股份有限公司；MTT溶液：AR，Sigma公司；L929细胞：西京医院皮肤科。
ARX-400核磁共振仪(瑞士Brucker公司)；R-205旋转蒸发仪(上海申顺生物科技有限公司)；SH2-88A恒温振荡器(江苏正基仪器有限公司)；UV2450紫外-可见分光光度计(日本岛津)；Nicolet 5700型傅立叶变换红外光谱仪(美国Thermmo Electron公司)；FlexSEM1000扫描电镜(日本日立公司)；XRD-MiniFlex600X-射线衍射仪(日本理学公司)；Powerdry LL3000型真空冷冻干燥机(基因有限公司)；Multiskan FC酶标仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶的制备首先，称取15 g N-乙烯基咪唑于三口烧瓶中，氮气保护条件下，加入不同醚基链长的氯化物(分别加入15 g 2-氯乙基甲基醚、17.19 g 2-氯乙基乙醚、19.33 g 2-氯乙基丙醚)和0.1 g对苯二酚阻聚剂，70℃回流搅拌24 h，用20 mL乙酸和50 mL乙酸乙酯溶解沉淀，然后60℃下真空干燥12 h得3种[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3) 单体。其次，称取一定量[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)单体，分别加入N, N-亚甲基双丙烯酰胺、2.5 mL甲醇、2.5 mL乙醇和偶氮二异丁腈，通氮气20 min后密封体系，70℃下恒温油浴反应4 h，形成凝胶后切成小块，在30 mL超纯水中浸泡3 d，每4 h更换超纯水以去除未反应的小分子，然后冷冻干燥3~5 d至恒重后储存在真空干燥箱中待用。[C1OC2vim]Cl的1H NMR归属δ(CDCl3)：10.59(s, 1H), 8.62(q, 1H), 8.18(d, 1H), 7.82(s, 1H), 7.60(s, 1H), 6.43(d, 1H), 3.80(q, 1H), 3.50(q, 1H), 3.41(s, 3H)。[C2OC2vim]Cl的1H NMR归属δ(CDCl3)：10.62(s, 1H), 8.65(q, 1H), 8.14(d, 1H), 7.85(s, 1H), 7.57(s, 1H), 6.55(d, 1H), 3.77(q, 1H), 3.61(q, 1H), 1.22(t, 3H)。[C3OC2vim]Cl的1H NMR归属δ(CDCl3)：10.71(s, 1H), 8.59(q, 1H), 8.17(d, 1H), 7.80(s, 1H), 7.51(s, 1H), 6.40(d, 1H), 3.59(q, 1H), 3.52(q, 1H), 3.21(t, 3H), 1.32(m, 2H), 0.98(t, 3H)。其合成方法如图 1所示。
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| 图 1 P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶的合成方法 |
1) 溶胀性能：25℃下，将干凝胶分别浸泡在超纯水、不同pH值的缓冲溶液及不同浓度的NaCl模拟溶液中，一定时间后取出，用滤纸除去吸附在水凝胶表面的水分，称重，计算溶胀率RS。溶胀率的计算公式为：RS=(mt-md)/md×100%，式中mt表示t时刻时溶胀的凝胶质量，md表示干凝胶质量。
2) 生物相容性：在接种好的对数生长期L929细胞培养板中，按200 μL/孔加入50%浓度的凝胶的浸提液(实验前凝胶用无菌PBS清洗3遍)，浸泡时间分别为1, 3, 6, 24 h。接下来，在37℃、5%的CO2下培养细胞，测试组吸光度记为ODt，阳性对照组吸光度为ODn，阴性对照组吸光度为ODp，并计算细胞存活率和溶血率，评价凝胶的细胞毒性。
1.2.3 凝胶体外药物释放实验将P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶分别置于15 mL的0.003 mg/mL肠道抗菌类药物CIP、Ber溶液中，25℃下浸泡24 h后，冷冻干燥得载药凝胶。称取一定量载药凝胶分别于不同pH和盐模拟溶液中，置于恒温摇床(37℃, 100 r/min)，定时取样3 mL，并补充3 mL新鲜缓冲溶液。用紫外-可见光分光光度计测定取得样品的吸光度，计算出药物浓度，以药物累积释放量对时间作图[13]。
2 结果与讨论 2.1 P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶的制备制备条件对凝胶的结构与性能具有一定的调控作用，其中，交联剂和引发剂用量是重要的影响因素。在离子液体型单体用量、溶剂种类、反应温度一定的条件下，分别改变交联剂MBA、引发剂AIBN用量，P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶性能会发生改变，MBA、AIBN用量对P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶溶胀性影响如图 2所示。
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| 图 2 MBA和AIBN用量对P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶溶胀性影响 |
研究表明，P[COC2vim]Cl、P[C2OC2vim]Cl和P[C3OC2vim]Cl凝胶制备的最佳交联剂MBA用量分别为离子液体单体质量的2%, 4%和3%，最佳引发剂AIBN用量分别为离子液体单体质量的4%, 4%和3%。当MBA用量较少时，随着MBA用量增加，逐渐形成多孔网状结构，溶胀率升高。当MBA用量过多时，形成凝胶的交联密度增加，多孔网状结构过于紧密，溶胀率降低。当AIBN用量过少时，引发产生的活性位点太少，醚基咪唑类离子液体型单体很难凝胶化，形成的多孔网状结构不完整，导致溶胀率很低。随着AIBN用量的增加，引发产生的活性位点增多，形成完整的多孔网状结构，溶胀能力提高。然而，随着AIBN用量的持续升高，离子液体型单体发生聚合反应的程度加大，溶胀率下降。
2.2 P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶的红外光谱分析对3种[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)单体及其P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶进行了FTIR光谱表征。从图 3a)看出，1 232 cm-1处为醚键碳氧单键C-O的伸缩振动峰，1 650 cm-1处为碳碳双键C=C弯曲振吸收峰，3 083 cm-1处出现咪唑环上=C-H的伸缩振动峰，1 558 cm-1处为咪唑环上碳氮双键C=N的伸缩振动，920 cm-1处为乙烯基的碳氢单键C-H变形振动峰。在图 3b)中，1 715 cm-1处出现N, N′-亚甲基双丙烯酰胺上的C=O特征吸收峰，1 515 cm-1处是咪唑环C=N伸缩振动，1 095 cm-1处是醚基侧链C-O伸缩振动。与离子液体型单体的FTIR图 3a)相比，图 3b)中1 650 cm-1处未出现碳碳双键C=C弯曲振动吸收峰，说明[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)单体发生了聚合，形成了P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶。
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| 图 3 单体及聚离子液体的红外光谱图 |
溶胀时间、PH和盐等因素对P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶溶胀性能影响见图 4。图 4a)为P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶在25℃下在超纯水中溶胀率随时间的变化曲线。凝胶溶胀率随时间延长逐渐升高，在前1 h内凝胶溶胀率迅速增长，而1 h后溶胀变得缓慢，溶胀一定时间后均达到平衡状态。这是因为，溶胀初期，凝胶内部多孔网络结构中可以容纳水的空间大，随着溶胀时间的延长，溶胀逐渐接近平衡，可以容纳水的空间变小，溶胀率增长变得缓慢。P[COC2vim]Cl凝胶的最大溶胀率为4 514.29%，分别为P[C2OC2vim]Cl凝胶的1.52倍、P[C3OC2vim]Cl凝胶的1.93倍。由图 4b)可知，P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶具有良好的pH刺激响应性，其溶胀率随pH值升高呈现先增大后减小的趋势。在酸性条件下，醚键容易被质子化而发生断裂，凝胶的内部结构收缩，溶胀能力低，但随着pH值升高，烷氧侧链柔性舒张，凝胶内部结构扩张，使其在酸性范围内的溶胀能力增强。值得注意的是，当pH值为7.4时，3种凝胶的平衡溶胀率均达到最大值，在该条件下表现出强的pH刺激响应性。图 4c)为P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶在不同盐浓度模拟液下的刺激响应曲线。随着NaCl模拟盐溶液浓度的升高，醚键断链脱水，而且凝胶内部结构与盐模拟液介质间的渗透压差增大，导致凝胶内部结构收缩，凝胶的平衡溶胀率均呈现出降低的趋势，具有一定的盐刺激响应性。
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| 图 4 P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶溶胀性能 |
通过溶血实验和细胞毒实验，评价P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶的生物相容性。P[COC2vim]Cl(凝胶)、P[C2OC2vim]Cl(凝胶)和P[C3OC2vim]Cl(凝胶)对红细胞的溶血率分别为2.2%, 2.8%和3.1%，溶血率均小于5%，表明凝胶无溶血作用。用凝胶浸提液培养对数生长期L929细胞24 h后，细胞存活率仍保持在90%以上。结果表明，P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶具有良好的生物相容性。
2.5 P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶的体外药物控释人体内各个器官微环境的酸碱性、离子强度等存在较大差异，对药物定位输送、药物疗效具有重要影响。基于P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶载体在pH为7.4(与肠道微环境接近)时的强pH刺激响应性，选择西药环丙沙星(CIP)、中药黄连素(Ber)2种肠道抗菌类药物作为模型, 分别研究凝胶的体外释放性能。图 5为不同pH、盐模拟液中凝胶释药曲线。由图 5a)~5b)可知，凝胶药物累积释放率在12 h内迅速增大，且10 h释药率均低于60%，30 h后趋于稳定。凝胶在pH=7.4模拟肠液中30 h内累积释放率最大，均大于45%，在pH=6.8模拟液中的累积释放率均在20%内，而在pH=1.2的模拟胃液中的累积释放率最低，均小于4%。由图 5c)和5d)可知，在一定浓度的盐模拟液中，随着释放时间的延长，凝胶的药物累积释放率逐渐增大并趋于稳定，凝胶在1 h的释药均小于15%，30 h时释放接近平衡。与0.03 mol/L NaCl溶液相比，当盐浓度升高至0.15 mol/L时，药物累积释放率均有所降低，表明P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶释药过程的缓释效果较好，对介质的盐浓度具有一定选择性。
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| 图 5 P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶的释药曲线 |
值得注意的是，P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶对中药Ber的累积释放率略高于西药CIP，这可能是由于CIP与凝胶之间的电荷相互作用弱，导致累积释放率低。其中，短醚基侧链P[COC2vim]Cl凝胶作为弱碱性的肠道抗菌药物载体，其药物累积释放率更高，这与其溶胀行为及刺激响应性研究结果一致。
2.6 P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶的释药机制药物释放是一个非常复杂的过程[14]，凝胶的释药机制研究具有重要意义。通过对药物累积释放率与释药时间进行数据拟合，其中，零级动力学方程Q=a0+k0t、一级动力学方程ln(1-Q)=a1+k1t和Higuchi方程Q=a2+k2t1/2，式中，Q为药物在某一时刻的累积释放率，t为释放时间，k0, k1和k2分别为3个方程的药物释放速率常数，拟合结果分别见表 1和表 2。短醚基侧链P[COC2vim]Cl凝胶中一级动力学方程里的R2最大，释药符合一级动力学。随着醚基链微增长，释药机制发生变化。在释药过程中，处于凝胶载体表面的药物先扩散，载体内部结构中大量的药物再扩散溶解，之后载体表层会出现小部分溶蚀且伴有少量药物溶出，渗透压变小，释药过程趋于动态平衡，因此，P[CnOC2vim]Cl(n=2, 3)凝胶载体符合Higuchi动力学方程。
| 凝胶 | 零级动力学反应 | 一级动力学反应 | Higuchi方程 |
| P[COC2vim]Cl | Q=2.805t-5.587 0.935 6 |
ln(1-Q)=-0.060t+4.666 0.991 8 |
Q=19.146t1/2-21.443 0.972 5 |
| P[C2OC2vim]Cl | Q=1.720t-3.990 0.938 0 |
ln(1-Q)=-0.025t+4.587 0.969 2 |
Q=11.949t1/2-12.642 0.977 9 |
| P[C3OC2vim]Cl | Q=1.595t-3.433 0.894 4 |
ln(1-Q)=-0.022t+4.586 0.929 9 |
Q=11.159t1/2-12.241 0.947 3 |
| 凝胶 | 零级动力学反应 | 一级动力学反应 | Higuchi方程 |
| P[COC2vim]Cl | Q=2.968t+3.750 0.914 7 |
ln(1-Q)=-0.065t+4.682 0.976 2 |
Q=19.331t1/2-19.986 0.930 4 |
| P[C2OC2vim]Cl | Q=1.926t+7.005 0.883 0 |
ln(1-Q)=-0.030t+4.561 0.928 4 |
Q=12.815t1/2-9.207 0.939 8 |
| P[C3OC2vim]Cl | Q=1.528t+5.643 (0.913 0) |
ln(1-Q)=-0.021t+4.561 (0.947 9) |
Q=10.120t1/2-7.075 (0.961 7) |
1) 从分子设计角度出发，在N-乙烯基咪唑类阳离子中引入醚基官能团，设计合成了3种pH/盐双敏性、多孔网状结构的聚醚基咪唑类离子液体凝胶P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)，凝胶无溶血作用且细胞毒性低。
2) 与课题组前期制备的PC2vimBr烷基咪唑类聚离子液体凝胶的最优溶胀率为1 422.3%相比[8]，短醚基链P[COC2vim]Cl凝胶的溶胀率提高了约2倍，pH、盐刺激响应性相对更敏感。
3) P[CnOC2vim]Cl(n=1, 2, 3)凝胶对肠道杀菌类药物环丙沙星和黄连素均具有缓控释作用，在pH为7.4的模拟肠液中累积释放率高，靶向给药能力较为明显。P[COC2vim]Cl凝胶在模拟胃肠液中释药规律符合一级动力学方程，而P[CnOC2vim]Cl(n=2, 3)凝胶释药规律符合Higuchi动力学方程。
| [1] | YAROSLAVOV A A, SYBACHIN A V. Multifunctional carriers for controlled drug delivery[J]. Pure and Applied Chemistry, 2020, 92(6): 919-939. DOI:10.1515/pac-2019-1111 |
| [2] | BAZBAN-SHOTORBANI S, HASANI-SADRABADI M M, KARKHANEH A, et al. Revisiting structure-property relationship of pH-responsive polymers for drug delivery applications[J]. Journal of Controlled Release, 2017, 253: 46-63. DOI:10.1016/j.jconrel.2017.02.021 |
| [3] | CINAY G E, ERKOC P, ALIPOUR M, et al. Nanogel-integrated pH responsive composite hydrogels for controlled drug delivery[J]. ACS Biomaterials Science & Engineering, 2017, 3(3): 370-380. |
| [4] | ZHANG K H, FENG X L, YE C N, et al. Hydrogels with a memory: dual-responsive, organometallic poly(ionic liquid)s with hysteretic volume-phase transition[J]. Journal of the American Chemical Society, 2017, 139: 10029-10035. DOI:10.1021/jacs.7b04920 |
| [5] | LE X X, LU W, XIAO H, et al. Fe3+-, pH-, thermoresponsive supramolecular hydrogel with multishape memory effect[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2017, 9(10): 9038-9044. |
| [6] | RUWIZHI N, ADERIGBE B A. The Efficacy of cholesterol-based carriers in drug delivery[J]. Molecules, 2020, 25(18): E4330. DOI:10.3390/molecules25184330 |
| [7] | DAS D, GHOSH P, GHOSH A, et al. Stimulus-responsive, biodegradable, biocompatible, covalently cross-linked hydrogel based on dextrin and poly(N-isopropylacrylamide) for in vitro/in vivo controlled drug release[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2015, 7(26): 14338-14351. |
| [8] |
赵亚梅, 刘星悦, 李泽城, 等. pH/盐双敏感型聚离子液体凝胶的制备及对环丙沙星的控制释放[J]. 功能材料, 2021, 52(5): 5006-5011.
ZHAO Yamei, LIU Xingyue, LI Zecheng, et al. Preparation of pH/salt dual-sensitive polyionic liquid gels and controlled release of ciprofloxacin[J]. Functional Materials, 2021, 52(5): 5006-5011. (in Chinese) DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2021.05.002 |
| [9] |
周春林. 功能基团对高分子链内及链间相互作用的影响[J]. 复旦学报, 1994, 33(2): 165-172.
ZHOU Chunlin. The effect of functional groups on the intra-chain and inter-chain interactions of polymers[J]. Journal of Fudan University, 1994, 33(2): 165-172. (in Chinese) |
| [10] | CHEN H, XU X Z, GONG S D, et al. A comparison of ether- and alkyl-imidazolium-based ionic liquids diluted with CH3CN: a combined FTIR and DFT study[J]. Journal of Molecular Liquids, 2020, 313(9): 113542. |
| [11] |
邸阳. 醚基阳离子功能化离子液体热力学性质及分子间相互作用的研究[D]. 锦州: 渤海大学, 2020 DI Yang. Study on the thermodynamic properties and intermolecular interactions of ether-based cation-functionalized ionic liquids[D]. Jinzhou: Bohai University, 2020 (in Chinese) |
| [12] | RAJ J J, MAGARET S, PRANESH M, et al. Dual functionalized imidazolium ionic liquids as a green solvent for extractive desulfurization of fuel oil: toxicology and mechanistic studies[J]. Journal of Cleaner Production, 2019, 213: 989-998. DOI:10.1016/j.jclepro.2018.12.207 |
| [13] |
毕玉水. 时间控制/pH依赖型盐酸黄连素结肠给药系统的控释性能[J]. 材料导报, 2018, 32(12): 1973-1977.
BI Yushui. Controlled release performance of time-controlled/pH-dependent berberine hydrochloride colonic delivery system[J]. Materials Review, 2018, 32(12): 1973-1977. (in Chinese) DOI:10.11896/j.issn.1005-023X.2018.12.006 |
| [14] |
李润萍. 喘平缓释制剂体外释药机制的研究[D]. 广州: 广东药学院, 2012 LI Runping. Study on the in vitro release mechanism of chuanping sustained-release preparations[D]. Guangzhou: Guangdong College of Pharmacy, 2012 (in Chinese) |
2. Research Institute of Shaanxi Yanchang Petroleum (Group) Co., Ltd., Xi'an 710061, China;
3. School of Urban Planning and Engineering, Xi'an Polytechnic University, Xi'an 710600, China
